Многофункциональные наностары Fe3O4 @ Au core / shell: уникальная платформа для многомодовой визуализации и фототермической терапии опухолей

1. Формирование и характеристика NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA Согласно нашей предыдущей работе 10 ...
2. Фотоакустические свойства и фототермические характеристики NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA
3. Анализы гемолитической и цитотоксичности
4. Анализ клеточного поглощения in vitro и целевая МРТ и КТ визуализация раковых клеток
5. Фототермическая абляция раковых клеток in vitro
6. МРТ / КТ / РА в трехцветном режиме in vivo для модели ксенотрансплантированной опухоли
7. PTT in vivo на модели ксенотрансплантированной опухоли
8. Гистологические исследования

Формирование и характеристика NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA

Согласно нашей предыдущей работе 10 NP3 Fe3O4 были синтезированы путем легкого восстановления для направленной МР визуализации опухолей in vivo . Эта легкая стратегия легкого сокращения позволила создать NP Fe3O4 с ультравысокой релаксивностью r2. В этом исследовании, в соответствии с тем же подходом, мы синтезировали стабилизированные Са Са НЧ Fe3O4 (Fe3O4 @ CA) и дополнительно создали затравочные частицы Fe3O4 / Ag путем восстановления NaBH4 Ag (I) в присутствии НЧ Fe3O4 @ CA согласно литература 41 , Образовавшиеся затравочные частицы Fe3O4 / Ag имеют достаточно однородный размер ( Дополнительный рис. S1a ) со средним размером 9,3 нм ( Рис. S1b ). Кажущийся пик поглощения при 400 нм можно отнести к пику SPR компонента Ag ( Рис. S1c ), подтверждая образование частиц затравки Fe3O4 / Ag. Точно так же существование как Ag, так и Fe в спектре дисперсии энергии ( Рис. S1d ) также подтвердил образование затравочных частиц Fe3O4 / Ag. Состав затравочных частиц Fe3O4 / Ag далее количественно определяли, используя ICP-OES, и молярное отношение Fe3O4 / Ag было измерено как 1,9: 1.

При воздействии на семена Fe3O4 / Ag ростового раствора Au образуется звездообразный Fe3O4 @ Au. NIR-абсорбционная характеристика NS была подтверждена с помощью УФ-спектроскопии ( Дополнительный рис. S2 ). Оптимизируя концентрацию химических веществ, были получены NS Fe3O4 / Au с желаемой характеристикой поглощения в NIR, используя ростовой раствор Au, содержащий 2,4 мМ HAuCl4, 0,08 мМ AgNO3, 5,2 мМ АА. Сформированные CTAB-стабилизированные Fe3O4 @ Au NS показывают уникальные звездообразные пики с узким распределением по размерам ( Дополнительный Рис. S3 ). Чтобы заставить функционировать NS, NS обильно промывали для удаления поверхностно-активного вещества CTAB и модифицировали PEI-SH посредством образования связи Au-S в соответствии с нашей предыдущей работой. 39 , Синтезированный PEI-SH был охарактеризован с помощью 1Н ЯМР, чтобы иметь 15,3 тиоловых группы на PEI ( Дополнительный рис. S4a ). Сгенерированные PEI-стабилизированные Fe 3 O 4 @ Au (Fe 3 O 4 @ Au-PEI) с большим количеством первичных аминов были затем привиты COOH-PEG-FA, который характеризовался наличием 0,8 фрагментов FA на ПЭГ с помощью 1H ЯМР ( Рис. S4b ). Ожидается, что эта модификация FA на NS через спейсер PEG обеспечит NS высокой аффинностью к раковым клеткам, сверхэкспрессирующим FAR 19 , Наконец, синтезированные NS Fe3O4 @ Au-PEI-PEG-FA подвергли реакции ацетилирования, чтобы нейтрализовать остаточные поверхностные амины PEI, чтобы улучшить их цитосовместимость. 42 ,

Дзета-потенциал и гидродинамический размер НС, образующихся на каждом этапе, были измерены, чтобы подтвердить их поверхностную модификацию ( Дополнительная таблица S1 ). Ясно, что NS Fe3O4 @ Au-PEI обладают весьма положительным поверхностным потенциалом (+31,4 мВ) благодаря модификации поверхности PEI с большим количеством аминов. После последовательной модификации COOH-PEG-FA и реакции ацетилирования поверхностные потенциалы NS Fe3O4 @ Au-PEI-PEG-FA и Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA составили +28,3 и +14,4. мВ соответственно. Сниженный поверхностный потенциал для обоих NS подтвердил успешность модификации COOH-PEG-FA и реакции ацетилирования по сравнению с таковой для Fe3O4 @ Au-PEI NS. Аналогично, гидродинамические размеры NS Fe3O4 @ Au-PEI-PEG-FA (226,1 нм) и Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA (224,2 нм) больше, чем у NS Fe3O4 @ Au-PEI ( 211,3 нм), что свидетельствует об успешной модификации поверхности НЗ. Кроме того, гидродинамический размер конечных NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA также иногда измеряли в течение периода времени 15 дней ( Дополнительный Рис. S5 ). Мы показываем, что гидродинамический размер НЗ не демонстрирует каких-либо явных колебаний, что свидетельствует об их похвальной коллоидной стабильности. Кроме того, долговременную коллоидную стабильность NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA оценивали, подвергая их воздействию различных сред (вода, PBS и DMEM, содержащих 10% FBS, соответственно), по меньшей мере, в течение одного месяца ( Рис. S5 и вставка). Частицы не осаждаются, что еще раз подтверждает их длительную коллоидную стабильность.

Для количественной оценки конъюгированных PEI и COOH-PEG-FA на поверхности Fe3O4 @ Au NS проводили TGA ( Дополнительный Рис. S6 ). При температуре 700 ° C покрытие PEI приводит к потере веса на 4,8% для NS Fe3O4 @ Au-PEI по сравнению с NSC без CTAB Fe3O4 @ Au. Дальнейшее конъюгирование COOH-PEG-FA дает Fe3O4 @ Au-PEI-PEG-FA NS с увеличенной потерей веса на 12,4%. Следовательно, модифицированный COOH-PEG-FA на NS был выведен на 7,6%.

Оптическое свойство NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA было исследовано с помощью УФ-спектроскопии ( Рис. 1б ). Темно-синий цвет NS в водном растворе был приписан звездообразному покрытию оболочки Au на поверхности частиц ( Рис. 1б , вставка). Очевидный пик SPR в области NIR на длине волны 810 нм хорошо виден, и функция поглощения NIR не демонстрирует очевидных изменений, даже когда NS облучают лазером с длиной волны 808 нм при 2,0 Вт / см2 в течение 20 минут. Это говорит о том, что НС обладают отличной фототермической стабильностью, а также большим потенциалом использования их для РТТ опухолей. ТЕМ использовали для наблюдения за морфологией и размером NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA ( Рис. 1c – e ). Хорошо видно, что НЗ с покрытием Au-оболочки на поверхности НЧ Fe3O4 обладают четко определенной формой звезды и довольно равномерным распределением по размерам ( Рис. 1с ). При измерении двух максимальных полей НЗ средний диаметр НС составил 149,6 ± 21,5 нм ( Рис. 1г ). Как изображено в Рис. 1е изображение ПЭМ с высоким разрешением показывает четкие решетки кристаллов оболочки типа спайка, а также плотное полимерное покрытие на внешней поверхности NS, что имеет отношение к модификации PEI и прививке COOH-PEG-FA. Элементный состав Fe и Au в NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA был количественно определен с помощью ICP-OES, и было измерено молярное отношение Fe / Au, равное 1: 53,4.

МРТ и КТ фантомные исследования

Fe3O4 NP обычно используются в качестве МР контрастных агентов из-за их способности сокращать время релаксации T2 окружающих их протонов воды. Из T2-взвешенной МР-томографии мы можем обнаружить, что генерируемые NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA могут постепенно уменьшать интенсивность МР-сигнала воды с увеличением концентрации Fe ( Рис. 2а ). Путем линейного подбора скорости релаксации T2 (1 / T2) в зависимости от концентрации Fe, релаксивность r2 для NS была рассчитана как 549,07 мМ-1с-1 ( Рис. 2б ). Сверхвысокая r2 релаксивность НС должна быть обусловлена ​​природой подхода мягкого восстановления, используемого для синтеза НЧ Fe3O4, в соответствии с литературой 10 , Похоже, что покрытие оболочки Au не оказывает существенного влияния на доступ протонов воды к внутренним НЧ Fe3O4, в основном из-за промежутков между междоузлиями Au каждого из НЗ.

Рисунок 2: МР-релаксометрия, свойство ослабления рентгеновских лучей, фотоакустические свойства и фототермические характеристики Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA NS.

( а ) T2-взвешенные МР-изображения и ( б ) линейная аппроксимация 1 / T2 NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA в зависимости от концентрации Fe. ( c ) КТ-изображения и ( d ) линейная аппроксимация значений КТ (HU) NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA при концентрации Au 4, 8, 16, 32 и 64 мМ соответственно. ( e ) PA-изображения и ( f ) линейная аппроксимация значений PA для NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA при концентрации Au 0, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мМ соответственно. ( g ) Изменение температуры воды и воды, содержащей НС Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA, при различных концентрациях Au (1, 2, 4, 10 и 20 мМ соответственно) при лазерном облучении 808 нм с та же плотность мощности 1,0 Вт / см2 как функция времени облучения. ( h ) Изменение температуры водного раствора, содержащего ЯО Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA при концентрации Au 10 мМ при лазерном облучении 808 нм с различными плотностями мощности (0,25, 0,5, 1,0 и 1,5 Вт. / см2, соответственно) как функция времени облучения.

С другой стороны, фантомные КТ-исследования NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA были проведены для изучения их потенциала для визуализации КТ ( Рис. 2с ). Хорошо видно, что с увеличением концентрации Au изображение CT водной суспензии, содержащей NSs, постепенно становится ярче, что хорошо согласуется с количественным измерением их значения CT (HU) в зависимости от концентрации Au ( Рис. 2d ).

Фотоакустические свойства и фототермические характеристики NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA

Чтобы изучить возможность использования NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA для визуализации PA, сначала были проведены фантомные исследования PA ( Рис. 2e ). Ясно, что с концентрацией Au в NS, интенсивность сигнала PA постепенно увеличивается, что хорошо коррелирует с количественным изменением интенсивности сигнала PA в зависимости от концентрации Au ( Рис. 2f ).

Затем было исследовано фототермическое поведение NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA, чтобы раскрыть их потенциал для использования при РТТ опухолей. Изменение температуры водного раствора, содержащего NSs, в зависимости от концентрации Au (1–20 мМ) непрерывно контролировали в режиме реального времени после воздействия лазера с длиной волны 808 нм при 1,0 Вт / см2 в течение 300 с ( Рис. 2g ). Ясно, что НС способны вызывать положительное повышение температуры в зависимости от концентрации. Температура суспензии NS может достигать 63,3 ° C при концентрации Au 20 мМ. Для сравнения, лазерное облучение чистой воды в тех же условиях не дает явного повышения температуры. При заданной концентрации Au 10 мМ также контролировали суспензию NS, облученную лазером 808 нм при различных плотностях выходной мощности (0,25–1,5 Вт / см2) в течение 300 с, для проверки изменения температуры ( Рис. 2h ). Очевидно, что NS способны генерировать тепло в зависимости от плотности мощности излучения лазера. Температура суспензии NS повышается до 68,5 ° C при максимальной плотности выходной мощности лазера (1,5 Вт / см2). Эти результаты указывают на то, что синтезированные NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA способны быстро превращать NIR-лазер в тепло под воздействием лазерного излучения. Эффективность фототермического преобразования (η) НС была рассчитана в соответствии с литературой 43 , 44 , Подробности можно увидеть в Дополнительная информация , Было рассчитано, что η NS составляет 88,9%, что значительно выше, чем у других основных агентов РТТ. 43 , 44 , 45 , 46 ,

Анализы гемолитической и цитотоксичности

Для биомедицинских применений крайне важно оценить гемосовместимость и цитосовместимость приготовленных NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA. Гемолитическую активность НС оценивали гемолитическим анализом ( Дополнительный рис. S8a ). По сравнению с положительным контролем воды, где наблюдается явное гемолитическое поведение, NSs при различных концентрациях Au не проявляют заметного эффекта гемолиза, подобно отрицательному контролю PBS (вставка Рис. S8a ). Процент гемолиза HRBC, подвергшихся воздействию раствора NS при различных концентрациях Au, был рассчитан как 0,39%, 1,79%, 2,51% и 4,39% соответственно, что все меньше порогового значения 5%, что указывает на их превосходную гемосовместимость в заданный диапазон концентрации Au 47 , 48 ,

Цитосовместимость Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA NS оценивали с помощью МТТ-анализа жизнеспособности клетки HeLa ( Рис. S8b ). По-видимому, после культивирования клеток HeLa с NSs в концентрации Au 0,2, 0,4, 0,8, 1,5 и 2,0 мМ, соответственно, в течение 24 часов, жизнеспособность клеток по-прежнему сохраняется более 80%, что указывает на их незначительную цитотоксичность 19 , 47 , Цитосовместимость NS была дополнительно подтверждена путем наблюдения морфологии клеток HeLa ( Дополнительный Рис. S9 ). Ясно, что морфология клеток HeLa после обработки NS в данном диапазоне концентраций Au (0,2-2,0 мМ) ( Рис. S9b – f ) очень похож на клетки HeLa, обработанные PBS ( Рис. S9a ). Взятые вместе, разработанные NS NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA демонстрируют хорошую гемосовместимость и цитосовместимость в исследуемом диапазоне концентраций.

Анализ клеточного поглощения in vitro и целевая МРТ и КТ визуализация раковых клеток

Для подтверждения высокого сродства продуцированных NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA к раковым клеткам со сверхэкспрессией FAR проводили ICP-OES для анализа поглощения Au клетками HeLa ( Рис. 3а ). Очевидно, что и клетки HeLa-HFAR, и клетки HeLa-LFAR демонстрируют постепенно повышенное поглощение Au с концентрацией NS. При тех же концентрациях Au поглощение Au в клетках HeLa-HFAR, по-видимому, было выше, чем в клетках HeLa-LFAR (p <0,01). Это означает, что модифицированные лиганды FA на NS обеспечивают специфическое нацеливание NS на FAR-сверхэкспрессирующие раковые клетки через FA-опосредованный путь 49 , 50 , 51 , Удельное поглощение NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA дополнительно оценивали с помощью ПЭМ ( Рис. 3б, в ). Ясно, что клетки HeLa-HFAR, обработанные NS, демонстрируют заметное распределение в цитоплазму клеток ( Рис. 3б ). Напротив, только минимальные NS были способны обнаруживаться в клетках HeLa-LFAR, что связано с неспецифическим фагоцитозом или диффузией через клеточные стенки ( Рис. 3с ) 52 ,

Фигура 3: Анализ поглощения клеток in vitro, целевая МРТ и КТ-визуализация и фототермическая абляция клеток HeLa.

( а ) Поглощение Au клетками HeLa-HFAR и HeLa-LFAR после обработки NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA при различных концентрациях Au в течение 4 часов. Изображения ПЭМ ( b ) клеток HeLa-HFAR и ( c ) HeLa-LFAR после обработки NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA в течение 4 часов соответственно. ( d ) T2-взвешенные MR-изображения, ( e ) интенсивность MR-сигнала, ( f ) CT-изображения и ( g ) значение CT для клеток HeLa-HFAR и HeLa-LFAR, обработанных Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG- ФСН при различных концентрациях Fe или Au в течение 6 часов. ( h ) МТТ-анализ жизнеспособности клеток HeLa после обработки NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA в заданном интервале концентраций Au при лазерном облучении 808 нм в течение 5 минут. 1 и 2 представляют клетки HeLa-LFAR и HeLa-HFAR соответственно.

МРТ и КТ также были выполнены для дальнейшей проверки специфического нацеливания NS на клетки HeLa-HFAR. T2-взвешенные МР-изображения клеток HeLa-HFAR и HeLa-LFAR, обработанных NS, становятся темнее с увеличением концентрации Fe ( Рис. 3d ). Однако клетки HeLa-HFAR демонстрируют более заметное снижение интенсивности сигнала МР при тех же концентрациях Fe, что и клетки HeLa-LFAR. Это было дополнительно подтверждено путем количественной оценки интенсивности сигнала МР клеток HeLa-HFAR и HeLa-LFAR, обработанных NSs ( Рис. 3е ). С другой стороны, КТ-изображения и количественные значения КТ (HU) клеток, обработанных НС ( Рис. 3f, г ) показывают, что усиление контрастности КТ клеток HeLa-HFAR гораздо более очевидно, чем у клеток HeLa-LFAR (p <0,05) при тех же концентрациях Au, что указывает на то, что FA придает NS специфическую направленность к раковым клеткам, которые сверхэкспрессируют FAR. В целом, разработанные Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA NS могут быть использованы для специфической МР и КТ визуализации FAR-избыточно экспрессирующих раковых клеток in vitro .

Фототермическая абляция раковых клеток in vitro

Вдохновленные высокоэффективными фототермическими свойствами и специфичностью нацеливания с включенным FA, мы использовали NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA для PTT раковых клеток in vitro ( Рис. 3h ). По-видимому, клетки HeLa после обработки НС без лазерного облучения являются достаточно здоровыми с жизнеспособностью, сравнимой с таковыми, получавшими PBS (контроль). В противоположность этому, жизнеспособность клеток HeLa после обработки NS и облучения лазером с длиной волны 808 нм (1,0 Вт / см2) в течение 5 минут заметно снижается даже при концентрации Au, равной 0,1 мМ (р <0,001). С увеличением концентрации Au, NS оказывают более выраженный эффект абляции на раковые клетки, и 75,3% клеток HeLa могут быть убиты при концентрации Au 0,8 мМ.

РТТ раковых клеток с использованием NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA были дополнительно исследованы путем наблюдения морфологии клеток ( Дополнительный рис. S10 ). Ясно, что морфология клеток HeLa, обработанных PBS ( Рис. S10a, f ) и только NSs при концентрациях Au 0,1–0,8 мМ вполне здоровы ( Рис. S10b – e ). В противоположность этому, после лечения НС плюс лазерное облучение ( Рис. S10g – j ), Клетки HeLa отделяются и округляются даже при самой низкой концентрации Au 0,1 мМ, что указывает на то, что клетки подверглись апоптозу. Результаты наблюдений за морфологией клеток подтверждают данные анализа жизнеспособности МТТ, подтверждая превосходную эффективность NS для РТТ раковых клеток in vitro .

МРТ / КТ / РА в трехцветном режиме in vivo для модели ксенотрансплантированной опухоли

Затем была изучена возможность использования NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA для трехрежимной МР / КТ / ПА-визуализации ксенотрансплантированных опухолей HeLa in vivo . Как показано в Рис. 4а, б область опухоли становится заметно темной через 0,5 ч после внутриопухолевой (IT) инъекции или через 6 ч после внутривенной (IV) инъекции. Количественный анализ интенсивности MR-сигнала показывает, что интенсивность MR-сигнала опухоли резко снижается с 256,6 до 20,1 и с 362,7 до 247,7 для IT и IV инъекций соответственно (p <0,001) ( Рис. 4в, д ). Это подтверждает использование NS для МР-визуализации опухолей in vivo. Чтобы продемонстрировать специфичность нацеливания NS, свободную FA-блокированную опухоль HeLa также визуализировали с помощью МР после внутривенного введения в том же состоянии ( Дополнительный Рис. S11 ). Ясно, что область опухоли показала яркость, аналогичную яркости через 6 ч после внутривенной инъекции, таковой до инъекции Рис. S11a ), что может быть дополнительно подтверждено количественным анализом интенсивности сигнала МР ( Рис. S11b ).

Фигура 4: МРТ / КТ визуализация in vivo модели опухоли ксенотрансплантата.

( a , b ) T2-взвешенные MR-изображения, ( c , d ) интенсивность MR-сигнала, ( e , f ) CT-изображения и ( g , h ) CT-значение опухолей до и через 0,5 ч после IT ( a , c , e , g ) и через 6 ч после IV ( b , d , f , h ) введения NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA ([Fe] = 1,31 мМ, [Au] = 70 мМ, 0,1 мл в PBS).

Затем мы проверили возможность использования NS для КТ и ПА визуализации опухоли HeLa. При компьютерной томографии яркость опухолевого участка увеличивается через 0,5 ч после инъекции IT или через 6 ч после внутривенной инъекции ( Рис. 4e, f ). Это может быть дополнительно подтверждено путем сбора значения CT области опухоли ( Рис. 4г, ч ). Ясно, что значение КТ в месте опухоли значительно увеличивается с 32,6 до 364,9 HU через 0,5 ч после инъекции IT и с 30,4 до 43,0 HU через 6 ч после внутривенной инъекции, соответственно (p <0,01). Для визуализации PA, как только NS поглощают NIR-лазер и преобразуют его в тепло, окружающая среда может расширяться под действием этого тепла и генерировать ультразвуковой сигнал. Затем мы выполнили ПА и УЗИ опухолей. Как показано в Рис. 5а, в интенсивный сигнал PA области опухоли может быть легко визуализирован после IT и IV инъекции NSs мышам с опухолью. По сравнению с интенсивностью PA области опухоли перед инъекцией, интенсивность PA приблизительно в 20 раз и в 3 раза выше для инъекции IT (увеличение с 0,14 до 2,82) и внутривенной инъекции (увеличение от 0,14 до 0,41), соответственно (p <0,001, Рис. 5б, д ). Усиление МР / КТ / ПА визуализации опухоли должно быть связано с модификацией ПЭГ-илированного ЖК на поверхности частиц. С одной стороны (особенно для внутривенной инъекции), модификация PEGилирования NS позволяет им избегать поглощения ретикулоэндотелиальной системой (RES) и накапливаться в опухолевой ткани посредством пассивного пути нацеливания, основанного на улучшенной проницаемости и удержании (EPR). эффект 53 ; с другой стороны, при FA-опосредованном пути активного нацеливания, как продемонстрировано в исследованиях in vitro , NSs способны специфически нацеливаться на опухолевую ткань для высокоэффективной визуализации MR / CT / PA опухоли.

Ультразвуковые / PA изображения in vivo ( a , c ) и значение PA ( b , d ) опухолей до и через 0,5 ч после IT ([Au] = 100 мМ, 0,04 мл в PBS, a , b ) и через 6 ч после IV ([Au] = 100 мМ, 0,1 мл в PBS, c , d ) инъекция Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA NSs.

PTT in vivo на модели ксенотрансплантированной опухоли

Затем была проверена возможность использования NS Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA для тепловидения и РТТ опухолей ( Рис. 6 ). Прижизненная тепловая визуализация мышей проводилась в разные периоды времени лазерного облучения с использованием инфракрасной камеры. Как показано в Рис. 6а, б температура области Ar1 (вводимой с помощью NS) быстро повышается на 24,7 ° C в течение 150 с и на 30,8 ° C после 300 с облучения. В отличие от этого, для области Ar2 (вводимой с помощью PBS) наблюдалось небольшое повышение температуры, и температура повышалась только приблизительно на 5 ° C во время лазерного облучения.

Рисунок 6: Фототермическая визуализация in vivo и фототермическая абляция опухолей HeLa.

( a ) Фототермические снимки всего тела мышей с опухолями HeLa после инъекции IT 0,1 мл PBS (контроль, правая мышь, обозначенная в области Ar2) или Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA NS, диспергированные в 0,1 мл. PBS ([Au] = 20 мМ, левая мышь, указанная в области Ar1) с последующим воздействием лазера с длиной волны 808 нм с плотностью мощности 1,0 Вт / см2 в момент времени 0 мин, 2,5 мин и 5 мин. соответственно. ( б ) График повышения температуры в опухолевых областях (Ar1 и Ar2) в зависимости от времени облучения. ( c ) Профили изменения объема опухоли, ( d ) изменение массы тела и ( e ) коэффициент выживаемости мышей с опухолью (n = 4) как функция времени после обработки.

Ожидается, что эта высокая температура, вызванная НС под воздействием лазерного излучения, устранит опухоли. Далее мы исследовали изменение объема опухоли у мышей после различных обработок ( Рис. 6с ). Относительные объемы опухолей через 24 дня после лечения для групп контроля (PBS), PBS + Laser и NS примерно в 6–7 раз больше, чем у исходной опухоли. В противоположность этому, лечение с использованием лазера NSs plus позволяет полностью удалить опухоли через 7 дней после инъекции NS. Это ясно иллюстрирует возможность использования NS для высокоэффективного PTT опухолей. Эффективность РТТ опухолей можно легко визуализировать, фотографируя мышей ( Дополнительный рис. S12 ). Мыши в группе NSs + Laser сохраняют здоровье на 19-й день после обработки, и полностью удаленная опухолевая область, по-видимому, не рецидивирует в исследуемый период времени, что указывает на превосходную эффективность PTT в Fe3O4 @ Au-PEI.Ac-PEG-FA. NSS. Напротив, у мышей в группах Control, PBS + Laser и NSs опухоли становятся все больше и больше со временем. Следует отметить, что в течение экспериментального периода времени мыши с различным лечением способны поддерживать вес своего тела ( Рис. 6d ), предполагая, что лечение с использованием одного лазера, только НЗ или лазера плюс НС не токсично для мышей. Наконец, эффективность PTT опухолей оценивали путем мониторинга выживаемости мышей после различных обработок ( Рис. 6е ). Очевидно, что после лечения лазером NSs plus средняя выживаемость мышей сохраняется на уровне 100% через 60 дней. Однако мыши, получавшие PBS (контрольная группа), PBS плюс лазер и только NS, выживают со средней продолжительностью жизни 40 дней, 43 дня и 42 дня соответственно.

Гистологические исследования

Эффективность РТТ опухолей была дополнительно подтверждена гистологическими исследованиями с использованием окрашивания H & E и TUNEL окрашенных срезов опухоли ( Рис. 7 ). H & E окрашивание ( Рис. 7а ) показывает, что опухоли, обработанные лазером PBS плюс или только NS, демонстрируют нормальную морфологию опухолевых клеток HeLa, сходную с опухолями, обработанными PBS (контроль). Но для опухолей, обработанных лазером NSs plus, клетки некроза отчетливо видны во всем разделе. Аналогично, окрашивание TUNEL ( Рис. 7б ) показывает, что только очень небольшое количество положительного окрашивания апоптотических клеток можно обнаружить в срезах контрольной группы, PBS + Laser и NSs. В противоположность этому, после лечения NSs плюс лазерное облучение опухоли демонстрируют огромное количество положительного окрашивания апоптотических клеток. Данные количественного анализа также показывают, что процентное содержание апоптотических клеток в опухолях контрольной, PBS + Laser, NSs и NSs + Laser групп составляет 1,5%, 3,3%, 1,3% и 95,0% соответственно ( Дополнительный рис. S13 ).

Рисунок 7: Гистологические исследования.

( а ) H & E и ( б ) TUNEL окрашивание срезов опухоли после того, как опухолевых мышей лечили в различных условиях. Масштабная линейка, показанная на каждой панели ( a , b ), представляет 100 мкм.

Похожие

Комментарии